Un filtre de fluorescència és un component essencial del microscopi de fluorescència. Un sistema típic té tres filtres bàsics: un filtre d'excitació, un filtre d'emissió i un mirall dicroic. Normalment s'envasen en un cub de manera que el grup s'insereix junts al microscopi.
Com funciona un filtre de fluorescència?
Filtre d'excitació
Els filtres d'excitació transmeten llum d'una longitud d'ona específica i bloquegen altres longituds d'ona. Es poden utilitzar per produir diferents colors ajustant el filtre perquè només passi un color. Els filtres d'excitació vénen en dos tipus principals: filtres de pas llarg i filtres de banda. L'excitador sol ser un filtre de pas de banda que passa només les longituds d'ona absorbides pel fluoròfor, minimitzant així l'excitació d'altres fonts de fluorescència i bloquejant la llum d'excitació a la banda d'emissió de fluorescència. Tal com mostra la línia blava de la figura, BP és 460-495, el que significa que només pot passar per la fluorescència de 460-495 nm.
Es col·loca dins del camí d'il·luminació d'un microscopi de fluorescència i filtra totes les longituds d'ona de la font de llum excepte el rang d'excitació del fluoròfor. La transmissió mínima del filtre determina la brillantor i la brillantor de les imatges. Es recomana un mínim del 40% de transmissió per a qualsevol filtre d'excitació de manera que la transmissió sigui idealment >85%. L'amplada de banda del filtre d'excitació hauria d'estar completament dins del rang d'excitació del fluoròfor de manera que la longitud d'ona central (CWL) del filtre sigui el més propera possible a la longitud d'ona d'excitació màxima del fluoròfor. La densitat òptica (OD) del filtre d'excitació dicta la foscor de la imatge de fons; OD és una mesura de com un filtre bloqueja les longituds d'ona fora del rang de transmissió o ample de banda. Es recomana una DO mínima de 3,0, però una DO de 6,0 o més és ideal.
Filtre d'emissions
Els filtres d'emissió serveixen per permetre que la fluorescència desitjable de la mostra arribi al detector. Bloquegen longituds d'ona més curtes i tenen una alta transmissió per a longituds d'ona més llargues. El tipus de filtre també s'associa amb un número, per exemple BA510IF a la figura (filtre de barrera d'interferències), aquesta designació fa referència a la longitud d'ona al 50% de la seva transmissió màxima.
Les mateixes recomanacions per als filtres d'excitació són vàlides per als filtres d'emissió: transmissió mínima, amplada de banda, OD i CWL. Un filtre d'emissió amb la combinació ideal de CWL, transmissió mínima i OD proporciona les imatges més brillants possibles, amb el bloqueig més profund possible i garanteix la detecció dels senyals d'emissió més febles.
Mirall dicroic
El mirall dicroic es col·loca entre el filtre d'excitació i el filtre d'emissió en un angle de 45 ° i reflecteix el senyal d'excitació cap al fluoròfor mentre transmet el senyal d'emissió cap al detector. Els filtres dicroics i divisors de feix ideals tenen transicions nítides entre la màxima reflexió i la màxima transmissió, amb una reflexió >95% per a l'ample de banda del filtre d'excitació i una transmissió >90% per a l'ample de banda del filtre d'emissió. Seleccioneu el filtre tenint en compte la longitud d'ona d'intersecció (λ) del fluoròfor, per minimitzar la llum dispersa i maximitzar la relació senyal-soroll de la imatge fluorescent.
El mirall dicroic d'aquesta figura és el DM505, anomenat així perquè 505 nanòmetres és la longitud d'ona al 50% de la transmissió màxima d'aquest mirall. La corba de transmissió d'aquest mirall mostra una alta transmissió per sobre de 505 nm, una forta caiguda de la transmissió a l'esquerra de 505 nanòmetres i una reflectivitat màxima a l'esquerra de 505 nanòmetres, però encara pot tenir alguna transmissió per sota de 505 nm.
Quina diferència hi ha entre els filtres de pas llarg i de banda?
Els filtres de fluorescència es poden dividir en dos tipus: passa llarg (LP) i passa banda (BP).
Els filtres de pas llarg transmeten longituds d'ona llargues i bloquegen les més curtes. La longitud d'ona de tall és el valor al 50% de la transmissió màxima, i totes les longituds d'ona per sobre del tall es transmeten pels filtres de pas llarg. S'utilitzen freqüentment en miralls dicroics i filtres d'emissió. Els filtres de pas llarg s'han d'utilitzar quan l'aplicació requereix la màxima recollida d'emissions i quan la discriminació espectral no és desitjable o necessària, que és generalment el cas de sondes que generen una sola espècie emissora en exemplars amb nivells relativament baixos d'autofluorescència de fons.
Els filtres de pas de banda només transmeten una determinada banda de longitud d'ona i en bloquegen d'altres. Redueixen la diafonia permetent que només es transmeti la part més forta de l'espectre d'emissió de fluoròfors, redueixen el soroll d'autofluorescència i milloren així la relació senyal-soroll en mostres d'autofluorescència de fons alt, que els filtres de pas llarg no poden oferir.
Quants tipus de conjunts de filtres de fluorescència pot subministrar BestScope?
Alguns tipus de filtres habituals inclouen els filtres blaus, verds i ultraviolats. Com es mostra a la taula.
| Conjunt de filtres | Filtre d'excitació | Mirall dicroic | Filtre de barrera | Longitud d'ona del llum LED | Aplicació |
| B | BP460-495 | DM505 | BA510 | 485 nm | ·FITC: Mètode d'anticossos fluorescents ·Taronja acidínica: ADN, ARN ·Auramina: bacil tuberculós ·EGFP, S657, RSGFP |
| G | BP510-550 | DM570 | BA575 | 535 nm | ·Rodamina, TRITC: Mètode d'anticossos fluorescents ·Iodur de propidi: ADN · RFP |
| U | BP330-385 | DM410 | BA420 | 365 nm | ·Observació d'auto-fluorescència ·DAPI: tinció d'ADN ·Hoechest 332528, 33342: utilitzat per a la tinció de cromosomes |
| V | BP400-410 | DM455 | BA460 | 405 nm | ·Catecolamines ·5-hidroxi-triptamina ·Tetraciclina: Esquelet, Dents |
| R | BP620-650 | DM660 | BA670-750 | 640 nm | ·C5 ·Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647 |
Els conjunts de filtres que s'utilitzen en adquisicions de fluorescència estan dissenyats al voltant de les principals longituds d'ona utilitzades en aplicacions de fluorescència, que es basa en els fluoròfors més utilitzats. Per aquest motiu, també reben el nom del fluoròfor que estan destinats a la imatge, com els cubs de filtre DAPI (blau), FITC (verd) o TRITC (vermell).
| Conjunt de filtres | Filtre d'excitació | Mirall dicroic | Filtre de barrera | Longitud d'ona del llum LED |
| FITC | BP460-495 | DM505 | BA510-550 | 485 nm |
| DAPI | BP360-390 | DM415 | BA435-485 | 365 nm |
| TRITC | BP528-553 | DM565 | BA578-633 | 535 nm |
| FL-auramina | BP470 | DM480 | BA485 | 450 nm |
| Vermell de Texas | BP540-580 | DM595 | BA600-660 | 560 nm |
| mCherry | BP542-582 | DM593 | BA605-675 | 560 nm |
Com escolliu un filtre de fluorescència?
1. El principi de selecció del filtre de fluorescència és deixar passar la llum de fluorescència/emissió per l'extrem d'imatge tant com sigui possible i bloquejar completament la llum d'excitació alhora, per tal d'obtenir la relació senyal-soroll més alta. Especialment per a l'aplicació d'excitació multifotònica i microscopi de reflexió interna total, el soroll feble també causarà una gran interferència en l'efecte d'imatge, de manera que el requisit de relació senyal/soroll és més alt.
2. Conèixer l'espectre d'excitació i emissió del fluoròfor. Per construir un conjunt de filtres de fluorescència que generi una imatge d'alta qualitat i alt contrast amb un fons negre, els filtres d'excitació i emissió haurien d'aconseguir una alta transmissió amb una ondulació mínima de la banda de pas sobre les regions que corresponen als pics o emissions d'excitació del fluoròfor.
3. Considereu la durabilitat dels filtres de fluorescència. Aquests filtres han de ser impermeables a fonts de llum intensa que generen llum ultraviolada (UV) que podria provocar un "esgotament", especialment del filtre excitador, ja que està sotmès a tota la intensitat de la font d'il·luminació.
Les diferents imatges de mostra fluorescents
Els recursos es recullen i s'organitzen a Internet, i només s'utilitzen per a l'aprenentatge i la comunicació. Si hi ha alguna infracció, poseu-vos en contacte amb nosaltres per eliminar-la.
Hora de publicació: 09-12-2022