Un microscopi de fluorescència és un tipus de microscopi òptic que utilitza una font de llum d'alta intensitat per il·luminar la mostra i excitar els fluorocroms de la mostra. La il·luminació de l'exemplar es fa normalment amb una font de llum que emet llum ultraviolada. Són àmpliament utilitzats en camps biològic, mèdic i industrial.
Com funciona un microscopi de fluorescència?
Un microscopi de fluorescència utilitza una làmpada de mercuri o xenó per produir llum ultraviolada. La llum entra al microscopi i colpeja un mirall dicroic, un mirall que reflecteix un rang de longituds d'ona i permet que passi un altre rang. El mirall dicroic reflecteix la llum ultraviolada fins a l'exemplar. Alguns exemplars fluorescen de manera natural sota llum ultraviolada perquè contenen substàncies fluorescents com la clorofil·la. Si l'exemplar que s'ha de veure no fa una fluorescència natural, es pot tenyir amb colorants fluorescents anomenats fluorocroms.
En què consisteix un microscopi de fluorescència?
1. Font de llum
Les fonts de llum més habituals són el mercuri, el xenó i els LED. Mercury proporciona la millor qualitat de llum per al microscopi de fluorescència. Els LED són cada cop més populars perquè són menys cars que altres fonts i consumeixen menys energia.
| Làmpada de mercuri | Làmpada de xenó | LED | |
| Longitud d'ona de la llum emesa | 350-370 nm | 400 nm ~ 450 nm | 400-700 nm |
| Vida (hora) | 200-300 | 400-600 | 10000 |
| Avantatge | 1. Llum d'alta intensitat, les fonts de llum més habituals. 2. Emet forts ultraviolats i blau-violats per excitar tot tipus de fluoròfors. 3. Imatges brillants i acolorides. | 1. La intensitat espectral és estable. 2. Forta intensitat espectral en l'infraroig i l'infraroig mitjà. | 1. Fàcil de substituir. 2. No cal escalfar-se. 3. Es pot encendre i apagar a l'instant. 4. Controlar la intensitat de la font de llum. |
| Desavantatge | 1. Una vida curta. 2. Temps llarg d'escalfament. | 1. Es requereix una caixa d'alimentació CC de baixa tensió especial per a l'excés de calor. 2. Més car que la làmpada de mercuri | 1. La llum UV és més feble que la làmpada de mercuri. 2.Cada longitud d'ona de llum requereix un LED separat a causa de l'ample de banda que emeten. |
Adjunt fluorescent de mercuri
Adjunt fluorescent LED
2. Filtre d'excitació
El filtre d'excitació és essencial per al funcionament d'un microscopi de fluorescència. Passa la llum d'una longitud d'ona més curta, que el colorant fluorescent podria absorbir. A més, bloqueja les altres fonts de llum excitant.
Filtre d'excitació (B,G,U,V)
3. Mirall dicroic
El mirall dicroic és un tipus de filtre òptic que reflecteix la llum a determinades longituds d'ona mentre en transmet d'altres. S'utilitza en microscopis de fluorescència per separar les longituds d'ona d'excitació i d'emissió.
4. Filtre d'emissions
El filtre d'emissió només passa per les longituds d'ona emeses pel fluoròfor i bloqueja tota la llum no desitjada fora d'aquesta banda, especialment les longituds d'ona d'excitació.
5. Tints fluorescents
Els colorants fluorescents són compostos orgànics que posseeixen una propietat de fluorescència, mitjançant la qual poden formar una imatge fluorescent emetent llum verda visible de molt contrast després d'excitar-se per la llum ultraviolada altament il·luminadora. Els colorants fluorescents utilitzats habitualment són; DAPI (49,6-diamidino-2-fenilindol), taronja d'acridina, auramina-rodamina, Alexa Fluors o DyLight 488.
Quants tipus de microscopis de fluorescència?
1. Microscopi d'epifluorescència vertical:
És el tipus més comú de microscopi de fluorescència. L'excitació del fluoròfor i la detecció de la fluorescència es fan a través del mateix camí de llum (és a dir, a través de l'objectiu). La majoria dels microscopis de fluorescència, especialment els utilitzats en ciències de la vida, són de disseny d'epifluorescència.
Microscopi biològic fluorescent de recerca BS-2081F
2. Microscopi de fluorescència confocal:
Microscopi de fluorescència confocal: aquest tipus de microscopi de fluorescència combina l'escaneig làser amb il·luminació fluorescent per produir una imatge. Es pot utilitzar en una àmplia gamma d'aplicacions, com ara l'estudi de cèl·lules i teixits, la detecció de proteïnes i altres substàncies dins de les cèl·lules i la mesura del gruix dels materials.
Microscopi biològic fluorescent de recerca BS-2081F
3. Microscopi de fluorescència invertida
La font de llum i el condensador d'aquest tipus de microscopi es troben a la part superior, mirant cap avall. L'angle d'il·luminació ha de ser de 90 graus respecte a la superfície de la mostra que s'està examinant.
Microscopi fluorescent invertit BS-2095F
Quins són els avantatges i els inconvenients dels microscopis de fluorescència?
Avantatges:
- Permet l'observació de cèl·lules dels organismes vius sense danyar-les
- Proporciona imatges d'alta resolució amb colors precisos
- Permet l'estudi de processos vius a les cèl·lules
- Ser utilitzat per identificar diferents tipus de molècules dins de les cèl·lules, com ara proteïnes o àcids nucleics.
Inconvenients:
-Només permet l'observació d'estructures específiques dins d'una cèl·lula etiquetada amb el colorant fluorescent.
-El fotoblanqueig degut a l'excitació d'electrons durant el procés de fluorescència pot afectar les molècules reactives dels colorants fluorescents. Com a resultat, els colorants reactius podrien perdre la seva propietat química d'intensitat d'emissió de fluorescència.
-Les cèl·lules són susceptibles a l'efecte fototòxic després de la tinció amb colorants fluorescents, ja que les molècules de fluoròfor absorbeixen els fotons d'alta energia de la llum de longitud d'ona curta.
Quines són les aplicacions d'un microscopi de fluorescència?
Els microscopis de fluorescència s'utilitzen àmpliament en diversos camps d'investigació i aplicació, com ara la bioquímica, la biologia cel·lular, la microbiologia, la immunologia i la medicina.
1. En l'àmbit de la biologia, el microscopi de fluorescència permet la identificació precisa i detallada de components i activitats cel·lulars i submicroscòpiques amb l'ajuda de l'etiquetatge de colorants fluorescents.
2. En l'àmbit mèdic, el microscopi de fluorescència pot utilitzar reactius fluorescents per detectar la presència i distribució de bacteris i virus, o per ajudar a etiquetar dianes quirúrgiques per facilitar la cirurgia.
3. En l'àmbit de la mineralogia, el microscopi de fluorescència s'utilitza sovint per estudiar substàncies amb propietats de fluorescència espontània, com ara l'asfalt, el petroli, el carbó, l'òxid de grafè i altres minerals.
4. En la ciència dels materials, el microscopi de fluorescència es pot utilitzar en la indústria tèxtil o la indústria paperera per analitzar materials basats en fibres.
Hora de publicació: 14-mar-2023